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小鼠生長分化因子-15ELISA 試劑盒

產(chǎn)品編號：SEKM-0086

適用于小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本

背景介紹：
      生長分化因子-15(GDF-15)，又稱巨噬細(xì)胞抑制因子-1(MC-1)，胎盤轉(zhuǎn)化生長因子-β，前列腺衍生因子， 非甾體抗炎藥物激活基因，胎盤骨形成蛋白，是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的不同成員，是一種40 kda不活躍 的前體蛋白，被蛋白裂解釋放活性的C-末端片段，并以活性二硫鍵連接的同源二聚體的形式分泌到循環(huán)中。 在正常情況下，GDF-15在胎盤中高表達，在*、*、肺、*和前列腺等多種組織中表達量較低，在 中樞神經(jīng)系統(tǒng)上皮中也有表達，活化的巨噬細(xì)胞表達是由炎癥細(xì)胞因子IL-1β和TGF-β誘導(dǎo)的，GDF-15具 有多種生物學(xué)功能，在炎癥、癌癥和炎癥中起著重要的作用。GDF-15在動脈粥樣硬化或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等 炎癥狀態(tài)下升高，GDF-15在許多癌癥中表達增加，GDF-15的代謝效應(yīng)與調(diào)節(jié)食欲和能量穩(wěn)態(tài)的神經(jīng)元通路 有關(guān)。晚期癌癥或慢性疾病與小鼠和人類的厭食/惡病質(zhì)有關(guān)，GDF-15也發(fā)揮了心臟保護作用，在小鼠模型 中，GDF-15的誘導(dǎo)可保護心臟免受缺血/再灌注損傷，GDF-15的過度表達可減輕心室擴張和心力衰竭，在 人類中，血清GDF-15濃度與急性冠狀動脈綜合征的風(fēng)險及其預(yù)后有關(guān)。

檢測原理：
      Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠 GDF-15 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 GDF-15 會與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠 GDF-15 抗體，該抗體會與板子 上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 GDF-15 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP） 標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反 應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠 GDF-15 ，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì)， 加入終止液后反應(yīng)孔會變成黃色；*，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD）， 樣本中的小鼠濃度與 OD 成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出樣本中小鼠的濃度。

原理圖：

注意事項：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復(fù)凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高
于標(biāo)準(zhǔn)品的*值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預(yù)實驗以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準(zhǔn)備：
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入
37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1000?1?71?1?778?1?71?1?776L至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其完全溶解后 輕輕混勻(濃度為1000pg/ml)，按照以下濃度進行2倍稀釋： 250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9、 0pg/ml進行稀釋。250pg/ml作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的*點濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零 點（0pg/ml）。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將 其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍

應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。

6. 洗滌方法： 

自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。 

手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩 凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

結(jié)果判斷：

1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

2.計算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值

3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中GDF-15含量可通過對應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。

參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算小鼠 GDF-15的樣本含量

2. 靈敏度：
*可檢測小鼠 GDF-15 濃度達 2pg/ml，
20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差，計算相應(yīng)的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與小鼠 GDF-1、GDF-3、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-15 人的 GDF-11 等反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。

5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 GDF-15，計算回收率。

6. 線性稀釋：

分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 GDF-15，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動力學(xué)范圍內(nèi)進行稀 釋，評估線性。

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