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小鼠嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白2ELISA試劑盒

產(chǎn)品編號(hào)：SEKM-0058

適用于小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本

背景介紹：
       趨化因子(c-c motif)配體24 CCL24又稱髓系祖細(xì)胞抑制因子2(MPIF-2)或嗜酸性粒細(xì)胞趨化蛋白2(eotaxin-2)， Eotaxin-2(CCL24)與Eotaxin-1(CCL11) Eotaxin-3(CCL26)同屬于趨化因子CC亞家族成員,他們均選擇性的專一的與其共同的受體CCR3結(jié)合進(jìn)而趨化并激活嗜酸性粒細(xì)胞。嗜酸粒細(xì)胞趨化蛋白2在空腸和脾組織中表達(dá)。該編碼含119個(gè)氨基酸殘基，前體蛋白約為58%氨基酸序列與人類嗜酸細(xì)胞趨化因子2具同源性。嗜酸性粒胞趨化因子2也具有抑制髓樣細(xì)胞增殖的能力，于靜止的T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的輕微趨化作用。


檢測(cè)原理：
      Solarbio  ELISA試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)技術(shù)。將抗小鼠CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2 會(huì)與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2 抗體，該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的小鼠CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2 ，則HRP會(huì)使無(wú)色TMB變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì)，加入終止液后反應(yīng)孔會(huì)變成黃色；*，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測(cè)定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD），樣本中的小鼠濃度與OD成正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計(jì)算出樣本中小鼠的濃度。


注意事項(xiàng)：
1.試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請(qǐng)不要使用過(guò)期的試劑。
2.試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請(qǐng)丟棄。
3.試劑盒使用前請(qǐng)?jiān)谑覝鼗謴?fù)30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4.在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測(cè)，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5.為避免交叉污染，請(qǐng)?jiān)谠囼?yàn)中使用1次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
6.濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過(guò)程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請(qǐng)離心處理（5-10 S即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí)，請(qǐng)用移液器小心吹打幾次。
7.除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請(qǐng)不要使用其他來(lái)源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。
8.為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測(cè)均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。


安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作小鼠員在使用時(shí)請(qǐng)帶上手套并注意防護(hù)；在操作過(guò)程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請(qǐng)用大量清水清洗；檢測(cè)血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請(qǐng)按國(guó)家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。


試劑盒組成及儲(chǔ)存：

自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購(gòu)）
1．酶標(biāo)儀（主波長(zhǎng)450nm，參考波長(zhǎng)630nm）
2．高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3．洗板機(jī)或洗瓶
4．37℃孵育箱
5．雙蒸水，去離子水，量筒等
6.   稀釋用聚丙烯試管


樣本收集及儲(chǔ)存：
1.細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無(wú)菌離心管，在4℃條件下1000×g離心10 min,然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。
2.血清樣本：
室溫血液自然凝固20 min后，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入2-8℃儲(chǔ)存），保存過(guò)程中如有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。
3.血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合20 min，在4℃條件下1000×g離心10 min，然后將上清等量分裝于小EP管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)可放入2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測(cè)結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測(cè)濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的*值，請(qǐng)將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測(cè)，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。


試劑準(zhǔn)備：
1.試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前30 min將試劑盒，待測(cè)樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請(qǐng)放入37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2.配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入4℃冰箱保存。
3.標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1000L至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待其完全溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，按照以下濃度進(jìn)行2倍稀釋：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0pg/ml進(jìn)行稀釋。1000pg/ml作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的*點(diǎn)濃度，標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的零點(diǎn)（0pg/ml）。復(fù)溶過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品原液（1000pg/ml）未用完的應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱。
4.生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測(cè)稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5.酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請(qǐng)?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。

6.洗滌方法：
自動(dòng)洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為300ul/孔,注與吸出間隔為30秒，洗板5次。
手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液300ul/孔，靜止30秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板5次。

結(jié)果判斷：
1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長(zhǎng)測(cè)定 OD 值。選擇雙波長(zhǎng)檢測(cè)，參考波長(zhǎng)為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長(zhǎng)檢測(cè)，請(qǐng)用 450 nm 的OD測(cè)定值減去630 nm的OD測(cè)定值。
2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均OD值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去零孔的OD值
3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中含量可通過(guò)對(duì)應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。
4.若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè)，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。


參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠CCL24/Eotaxin-2/MPIF-2 的樣本含量。

2. 靈敏度：
*可檢測(cè)小鼠濃度達(dá)8pg/ml，
20個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度OD的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算相應(yīng)的可檢測(cè)濃度。

3. 特異性：
不與小鼠6Ckine 、Eotaxin、 MARC、 MIP-1α、 MIP-1β、 MIP-3α、 RANTES 、TARC IL-1 alpha、IL-1 beta、IL-2、 IL-3、 IL-3 Rb、IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-12 ，人的Eotaxin、 Eotaxin-2、 Eotaxin-3等反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。

5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3個(gè)不同濃度水平的小鼠 ，計(jì)算回收率。

6. 線性稀釋：
分別在選取的4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 ，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評(píng)估線性。