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| 產(chǎn)地 | 北京 |
| 品牌 | Solarbio |
| 貨號 | SEKM-0063 |
| 用途 | |
| 檢測方法 | 雙抗體夾心法 |
| CAS編號 | |
| 檢測限 | |
| 數(shù)量 | 20 |
| 包裝規(guī)格 | |
| 標記物 | 雙調(diào)蛋白 |
| 純度 | % |
| 樣本 | 血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液等樣本 |
| 應用 | Elisa實驗 |
小鼠雙調(diào)蛋白ELISA試劑盒
產(chǎn)品編號：SEKM-0063
適用于小鼠血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液等樣本
背景介紹：
雙調(diào)蛋白(AREG)是與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)同源的穿膜糖蛋白，其分子 C 端有相似的表皮生長因子 結(jié)構(gòu)．可刺激人成纖維細胞和腫瘤細胞的增殖，兩者在正常上皮組織均中低度表達。雙調(diào)蛋白(amphiregulin， AREG)是上皮細胞生長因子家族成員之一，間葉細胞和上皮細胞均組成性表達 AREG。AREG 通過自分泌、 近分泌和旁分泌等不同的方式，作用于上皮細胞生長因子受體(epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)。AREG 結(jié)合 EGFR 后，促進 EGFR 同型二聚體或者異型二聚體的形成，激活細胞下游多條信號通路 J，從而調(diào)控細 胞的分化和增殖。與其他上皮細胞生長因子家族成員比較，AREG 具有較低的 EGFR 結(jié)合能力，造成受體 內(nèi)化作用減弱，誘導出微弱但持久的細胞下游信號，產(chǎn)生不同于其他上皮細胞生長因子的生物學效應。
檢測原理：
Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將抗小鼠 Amphiregulin 單克隆抗體包被在酶標板上；分別加入梯度稀釋的標準品和預稀釋的樣本，標準品和樣本中 的小鼠 Amphiregulin 會與酶標板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化抗小鼠 Amphiregulin 抗 體，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標準品和樣本中的小鼠 Amphiregulin 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加 入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會發(fā)生高強度的非共價結(jié)合；洗板后 加入顯色劑底物 TMB，若反應孔中樣品存在不同濃度的小鼠 Amphiregulin ，則 HRP 會使無色 TMB 變成 不同深淺（正相關(guān)）的藍色物質(zhì)，加入終止液后反應孔會變成黃色；*，在λmax=450 nm（OD=450 nm） 處測定反應孔樣品吸光度（OD），樣本中的小鼠濃度與 OD 成正比，通過繪制標準曲線和四參數(shù)擬合軟件 便可計算出樣本中小鼠的濃度。
原理圖：
注意事項：
1. 試劑盒應在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時應保存在 2-8℃冰箱，已復溶但未用完的標準品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請在室溫恢復 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗中標準品和樣本建議作復孔檢測，且加入試劑的順序應保持一致。
5. 為避免交叉污染，請在試驗中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。
6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個組分。
8. 為保證結(jié)果準確，每次檢測均需做標準曲線。
安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時，請按國家生物
實驗室安全防護有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。
自備實驗器材（不提供，可代購）
1． 酶標儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管
樣本收集及儲存：
1. 細胞培養(yǎng)上清：
將細胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀，請再次離心，避免反復凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標本的實際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），避免反復凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標物檢測濃度高
于標準品的*值，請將樣品做適當倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實驗前做預實驗以確定稀釋倍數(shù)。
試劑準備：
1. 試劑回溫：首先在實驗前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入
37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預先計算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標準品梯度稀釋：加入標準品/樣本稀釋液（SR1）1000?1?71?1?778?1?71?1?776L至凍干標準品中，靜置15分鐘待其完全溶解后 輕輕混勻(濃度為2000pg/ml)，按照以下濃度進行2倍稀釋：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、 0pg/ml進行稀釋。2000pg/ml作為標準曲線的*點濃度，標準品/樣本稀釋液（SR1）作為標準曲線的零 點（0pg/ml）。復溶過的標準品原液（2000pg/ml）未用完的應廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將 其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。
4. 生物素化抗體工作液：預先計算好試驗所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍
應用工作液（稀釋前充分混勻），請在30分鐘內(nèi)加入到反應孔中。
5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應用工作液（稀釋前離心），請在30分鐘內(nèi)使用。
6. 洗滌方法：
自動洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。
手工洗板：甩盡酶標板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩 凈酶標板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。
結(jié)果判斷：
1.用酶標儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進行雙波長檢測，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。
2.計算標準品、樣品的平均 OD 值：每個標準品和標本的 OD 值應減去零孔的 OD 值
3.以標準品濃度為橫坐標，吸光度OD值為縱坐標，用軟件繪制標準曲線，樣品中Amphiregulin含量可通過對應OD 值由標準曲線換算出相應的濃度。
4.若標本 OD 值高于標準曲線上限，應做適當稀釋后重新檢測，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù)。
參數(shù)表征：
1. 數(shù)據(jù)及標準曲線
本圖僅供參考，應以當次試驗標準品繪制的標準曲線計算小鼠 Amphiregulin的樣本含量
2. 靈敏度：
*可檢測小鼠 Amphiregulin 濃度達 15pg/ml，
20 個零標準品濃度 OD 的平均值加上兩個標準差，計算相應的可檢測濃度。
3. 特異性：
不與小鼠 EGF、Epiregulin、Epigen 等反應。
4. 重復性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。
5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 Amphiregulin，計算回收率。
6. 線性稀釋：
分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 Amphiregulin，在標準曲線動力學范圍內(nèi)進行稀 釋，評估線性。
詳情請咨詢：010-56371250
