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小鼠P選擇素ELISA 試劑盒

產(chǎn)品編號(hào)：SEKM-0127

適用于小鼠血清、血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清液等樣本

背景介紹：
     小鼠 P-選擇素(又稱 CD62P、GMP-140 和 lecam-3)是白細(xì)胞粘附分子家族的一員，也包 括 E-選擇素(CD62E)L-選擇素(CD62l)。所有選擇素都是鈣依賴性受體，與白細(xì)胞表面糖蛋 白的碳水化合物結(jié)合，P-選擇素儲(chǔ)存在內(nèi)皮細(xì)胞血小板和維氏柵欄體的α顆粒中。成熟的 P-選擇素是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，含有 116 個(gè)氨基酸 N 端、C 型凝集素結(jié)構(gòu)域、42 aa EGF 樣結(jié)構(gòu)域、8 個(gè) 60~70 aa 短串聯(lián)重復(fù)序列(SCRs，又稱壽司結(jié)構(gòu)域)、一個(gè) 24 aa 跨膜片段和 一個(gè)短的 35 aa 胞質(zhì)區(qū)。小鼠 P-選擇素 EGF 樣結(jié)構(gòu)域與大鼠和人 P-選擇素結(jié)構(gòu)域的同源性 分別為 92%和 76%，與人和大鼠的同源性分別為 92%和 76%。成熟小鼠 P-選擇素與 E-選擇 素蛋白之間只有 35%的氨基酸序列同源性。

檢測原理：
      Solarbio ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù)。將 抗小鼠 P-selectin 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本， 標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 P-selectin 會(huì)與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合；洗板后加入生物素化 抗小鼠 P-selectin 抗體，該抗體會(huì)與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 P-selectin 發(fā)生特異性結(jié)合；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親 和素會(huì)發(fā)生高強(qiáng)度的非共價(jià)結(jié)合；洗板后加入顯色劑底物 TMB，若反應(yīng)孔中樣品存在不同 濃度的小鼠 P-selectin，則 HRP 會(huì)使無色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì)，加入 終止液后反應(yīng)孔會(huì)變成黃色；*，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸 光度（OD），樣本中的小鼠 P-selectin 濃度與 OD 成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合 軟件便可計(jì)算出樣本中小鼠 P-selectin 的濃度。

原理圖：

注意事項(xiàng)：
1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用，請不要使用過期的試劑。
2. 試劑盒未使用時(shí)應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品，請丟棄。
3. 試劑盒使用前請?jiān)谑覝鼗謴?fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品。
4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。
5. 為避免交叉污染，請?jiān)谠囼?yàn)中使用 1 次性試管，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器。

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少，在運(yùn)輸過程中微量液體會(huì)沾到管壁及瓶蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可），使管壁上的液體集中在管底部，取用時(shí)，請用移液器小心吹打幾次。
7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的試劑代替本試劑盒中的某單個(gè)組分。
8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

安全提示：
試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時(shí)請帶上手套并注意防護(hù)；在操作過程中也要避免試
劑接觸皮膚和眼睛，如果不慎接觸，請用大量清水清洗；檢測血液樣本及其它體液樣本時(shí)，請按國家生物
實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行。

自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購）
1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm，參考波長 630nm）
2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl
3． 洗板機(jī)或洗瓶
4． 37℃孵育箱
5． 雙蒸水，去離子水，量筒等
6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲(chǔ)存：
1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：
將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管，在 4℃條件下 1000 ×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝于小 EP 管于-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。
2. 血清樣本：
室溫血液自然凝固 20 min 后，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于
-20℃下保存（24 小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存），保存過程中如有沉淀，請?jiān)俅坞x心，避免反復(fù)凍融。
3. 血漿樣本：
將全血收集到含抗血凝劑的管中，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 20 min ，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24小時(shí)內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲(chǔ)存），避免反復(fù)凍融。
※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本，以免影響檢測結(jié)果；如果樣本中的靶標(biāo)物檢測濃度高
于標(biāo)準(zhǔn)品的*值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí)驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù)。

試劑準(zhǔn)備：
1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下，濃縮洗滌液如出現(xiàn)結(jié)晶，請放入
37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。
2. 配制洗滌液：預(yù)先計(jì)算好稀釋后的洗滌液使用體積，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。
3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中，靜置15分鐘待 其完全溶解后輕輕混勻(濃度為4000pg/ml)，然后按照以下濃度： 4000、2000、1000、 500、250、125、62.5、0 pg/ml進(jìn)行稀釋。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（4000pg/ml）未用完的 應(yīng)廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝，并將其貯存在-20～-80℃冰箱，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計(jì)算好試驗(yàn)所需用量，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃縮液稀釋成1倍

應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻），請?jiān)?0分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將100倍濃縮酶結(jié)合物稀釋成1 倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心），請?jiān)?0分鐘內(nèi)使用。

6. 洗滌方法： 

自動(dòng)洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，注入洗滌液為 300ul/孔,注 與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次。 

手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔，靜止 30 秒后甩 凈酶標(biāo)板孔中液體，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次。

結(jié)果判斷：

1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm。如不能進(jìn)行雙波長檢測，請 用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。

2.計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品、樣品的平均 OD 值：每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值

3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品中P-selectin含量可通過對應(yīng)OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測，計(jì)算濃度時(shí)再乘以稀釋倍數(shù)。

參數(shù)表征：

1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算小鼠 P-selectin 的樣本含量

2. 靈敏度：
*可檢測小鼠 P-selectin 濃度達(dá) 30pg/ml，
20 個(gè)零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，計(jì)算相應(yīng)的可檢測濃度。

3. 特異性：
不與小鼠 E-Selectin、ICAM-1、ICAM-2、L-Selectin、VCAM-1 等反應(yīng)。

4. 重復(fù)性：
板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10%。

5. 回收率：
在選取的健康小鼠血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個(gè)不同濃度水平的小鼠 P-selectin，計(jì)算回收率。

6. 線性稀釋：

分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 P-selectin，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀 釋，評(píng)估線性。