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莽草酸脫氫酶（SD）活性檢測(cè)試劑盒說明書
微量法
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
英文名稱：Valeric acid dehydrogenase (SD) activity detection kit
關(guān)鍵詞：莽草酸脫氫酶|莽草酸脫氫酶活性檢測(cè)|SD|SD活性檢測(cè)|SD活性測(cè)定
貨號(hào)：BC4185
規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存，用前搖勻。
試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 5mL 蒸餾水溶解。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前每瓶加入 10mL 蒸餾水溶解。

產(chǎn)品說明：
莽草酸途徑是存在于植物和微生物中的一條重要的代謝途徑，莽草酸脫氫酶(EC 1.1.1.25) 是莽草酸合成代謝途徑中催化第四步反應(yīng)的關(guān)鍵酶。
莽草酸脫氫酶催化莽草酸和 NADP 產(chǎn)生 NADPH，檢測(cè) 340nm 下的吸光值增加速率來表示 SD 活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、粗酶液提取：
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液（加入前搖勻））進(jìn)行冰浴勻漿，然后，8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
液體：直接檢測(cè)。
二、測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液的配制：按照試劑一：試劑二：試劑三為 7:4:8 的體積比例充分混勻，備用，用前 25℃預(yù)熱 15min。
3、 操作表：在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分別加入下列試劑：
試劑名稱     空白管 測(cè)定管
工作液（μL） 190 190
樣本（μL）            10
蒸餾水（μL）  10
加入樣本即開始計(jì)時(shí)，充分混勻后于 340nm 處測(cè)定 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 5min20s 時(shí)的吸光值A2，計(jì)算△A 測(cè)定管= A2 測(cè)定-A1 測(cè)定，△A 空白管=A2 空白-A1 空白，△A=△A 測(cè)定管-△A 空白管。
空白管只需做一次。計(jì)算△A= A2-A1?？瞻坠苤恍枳鲆淮?。

三、SD 酶活計(jì)算：
1、 按微量石英比色皿計(jì)算：
（1）按蛋白濃度計(jì)算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
SD 酶活（U/mg prot）= A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣×Crp）÷T= 643×△A÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活定義：每克樣品每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
SD 酶活（U/g 鮮重）= A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T
=643×△A÷W
（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
SD 酶活（U/104cell）= A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)））÷T= 643×△A÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
（4）按液體體積計(jì)算
酶活定義：每 mL 樣每分鐘產(chǎn)生 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
SD 酶活（nmol/min/mL）= A÷（ε×d）×109×V 反總÷V 樣÷T= 643×△A
ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/ mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；
V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.01mL；
Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；
W：樣本質(zhì)量，g，
T：反應(yīng)時(shí)間：5min。
2、 按 96 孔 UV 板計(jì)算：
將上述公式中的 d-1cm 改為 d-0.6cm（比色皿光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：
1、 樣本提取上清液置于冰上待測(cè)，且樣本提取完成后建議 2h 內(nèi)測(cè)完。
2、 樣品的蛋白濃度需自行測(cè)定，由于提取液中含有較高的蛋白濃度（約 10mg/mL），所以測(cè)定樣品
蛋白濃度時(shí)需扣除提取液自身蛋白濃度。
3、 △A 大于 1 時(shí)，建議將樣品稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)△A 小于 0.01 時(shí)，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（10min
或 15min）來測(cè)定。
4、 空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過 0.01。