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肉桂醇脫氫酶（CAD）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
英文名稱：Cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) activity assay kit
關(guān)鍵詞：肉桂醇脫氫酶|肉桂醇脫氫酶活性檢測|CAD|CAD活性檢測
貨號：BC4170
規(guī)格：50T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 15mL 試劑三溶解?？扇芙夂蠓盅b-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 1mL 乙醇溶解，再將其全部轉(zhuǎn)移至 15mL 棕色試劑瓶內(nèi)（盒中提供）并再加入 14mL 乙醇混勻，溶解后 4℃保存。
試劑三：液體 50mL×1 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說明：
CAD 是木質(zhì)素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一，催化香豆醛、芥子醛以及松柏醛等生成與之相應(yīng)的肉桂醇。該酶多存在于高等植物、酵母、菌類中，研究該酶可以探討多種生物細胞發(fā)育過程中木質(zhì)素沉積的代謝機理，為減少水果石細胞含量提高其品質(zhì)提供依據(jù)。
CAD 催化肉桂醛和 NADPH 生成肉桂醇和 NADP+，在 340nm 下測定 NADPH 消耗速率，即可反映CAD 活性。

試驗中所需的儀器和試劑：
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、1mL 石英比色皿、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰、乙醇和蒸餾水。

操作步驟：
一、粗酶液提?。?/span>
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清，置冰上待測。
細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104
個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；10000g 4℃離心
10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟：
1、 紫外分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液的配制：將試劑一、試劑二、試劑三按 1:1:2（V:V:V）的比例配制工作液，工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。
3、 操作表：在 1mL 石英比色皿中分別加入下列試劑：
試劑名稱     空白管 測定管
樣本（μL）           100
蒸餾水（μL）  100
工作液（μL）  900    900
在 1mL 石英比色皿中分別加入上述試劑，充分混勻后于 340nm 處測定 10s 時的吸光值
A1，迅速置于 25℃水浴 5min，拿出迅速擦干測定 5min10s 時的吸光值 A2，計算△A 測定管= A1
測定-A2 測定，△A 空白管=A1 空白-A2 空白，△A=△A 測定管-△A 空白管?？瞻坠苤恍枳鲆淮巍?/span>
三、CAD 酶活計算：
（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。
CAD 酶活（U/mg prot）= △A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T= 321.54×△A÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每 g 組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。
CAD 酶活（U/g 鮮重）= △A÷（ε×d）×109×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T=321.54×△A÷W
（3）按照細菌或細胞數(shù)量計算
酶活定義：每 104個細菌或細胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADPH 定義為一個酶活力單位。
CAD 酶活（U/104
cell）= △A÷（ε×d）×109×V 反總÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T
= 0.643×△A
ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/ mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.001L；
V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；
V 樣總：加入提取液體積，1mL；
Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；
W：樣本質(zhì)量，g，
T：反應(yīng)時間：5min；
500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬；
109：單位換算系數(shù)，1mol=109nmol。

注意事項：
1、 當 A1 小于 0.8，建議將樣品稀釋后再進行測定。
2、 空白管為檢測各試劑組分質(zhì)量的檢測孔，正常情況下，變化不超過 0.04。