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3-磷酸甘油酸激酶（PGK）活性檢測(cè)試劑盒說明書
微量法
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
英文名稱：3-phosphoglycerate kinase (PGK) activity assay kit
關(guān)鍵詞：3-磷酸甘油酸激酶|3-磷酸甘油酸激酶檢測(cè)|PGK|PGK檢測(cè)
貨號(hào)：BC2255
規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 120mL 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2.5mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑三：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加 1mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑四：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加 1mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。
試劑五：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 4mL 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

產(chǎn)品說明：
3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，也是生物得以生存的關(guān)鍵酶。廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，具有影響 DNA 復(fù)制和修補(bǔ)及刺激病毒 RNA 合成等生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于藥物靶標(biāo)設(shè)計(jì)。
3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和 ATP 產(chǎn)生 1,3-二磷酸甘油酸和 ADP，1,3-二磷酸甘油酸在3-磷酸甘油醛脫氫酶和 NADH 作用下產(chǎn)生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，引起 340nm 處的吸光度下降，即反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、粗酶液提?。?/span>
組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 10000g，4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。
血清/血漿：直接檢測(cè)。
二、測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 工作液的配制：按照蒸餾水：試劑一：試劑二：試劑三：試劑四：試劑五=6:10:2:1:1:4 的體積比例充分混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。
3、 操作表：在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分別加入下列試劑：

試劑名稱（μL）   空白管   測(cè)定管
工作液            180       180
樣本                         20
蒸餾水            20
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分別加入上述試劑，充分混勻后于 340nm 處測(cè)定 10s 時(shí)的吸光值 A1，迅速置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其他物種）水浴或培養(yǎng)箱 5min（酶標(biāo)儀有控溫功能可將溫度調(diào)至 37℃或 25℃），拿出迅速擦干測(cè)定 310s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算△A 測(cè)定管= A1 測(cè)定-A2測(cè)定，△A 空白管=A1 空白-A2 空白，△A=△A 測(cè)定管-△A 空白管。空白管只需做一次。
三、PGK 活性計(jì)算：
1、按微量石英比色皿計(jì)算：
（1）按照樣本蛋白濃度計(jì)算
酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
PGK（U/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總×109÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr
（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算
酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
PGK（U/g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總×109÷(W×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W
（3）按液體體積計(jì)算
酶活單位定義：每 mL 血清（漿）每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
PGK（U/g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總×109÷V 樣÷T=321.54×ΔA÷W
（4）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活單位定義：每 104個(gè)細(xì)胞每分鐘消耗 1 nmol 的 NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。
PGK（U/g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總×109÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.643×ΔA÷W
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；
ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V 樣：加入樣本體積，0.02mL；
V 樣總：加入提取液體積，1mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；
W：樣本質(zhì)量，g；
500：500 萬個(gè)細(xì)胞；
109：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=109nmol。
2、按 96 孔 UV 板計(jì)算：
將上述公式中的 d-1cm 改為 d-0.6cm（96 孔 UV 板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：
1. △A 大于 0.8 或者 A1 測(cè)定小于 0.9 時(shí)（96 孔 UV 板是當(dāng)△A 大于 0.5 或者 A1 測(cè)定小于 0.6 時(shí)），建議將粗酶液用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)△A 小于 0.01 時(shí)，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（10min 或 15min）或增加樣本體積來測(cè)定。
2. 空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過 0.01。
3. 樣品的蛋白濃度需自行測(cè)定，由于提取液中含有較高的蛋白濃度（約 10mg/mL），所以測(cè)定樣品蛋白濃度時(shí)需扣除提取液自身蛋白濃度。