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果糖-1,6-二磷酸（酯）酶（FBP）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法
注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
英文名稱(chēng)：Glucose-6-phosphatase activity assay kit
關(guān)鍵詞:葡萄糖-6-磷酸酶|G6P|G6P檢測(cè)
貨號(hào): BC0925
規(guī)格:100T/96S

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
果糖-1,6-二磷酸酶（Fructose 1,6-bisphosphatase，FBP）又稱(chēng)果糖-1,6-二***酶，其在糖異生過(guò)程和光合作用同化物蔗糖的合成中起關(guān)鍵性的作用。催化 1,6-二磷酸果糖和水生成 6-磷酸果糖和無(wú)機(jī)磷。
FBP 催化 1,6-二磷酸果糖和水，生成 6-磷酸果糖和無(wú)機(jī)磷，在反應(yīng)體系中添加的磷酸葡萄糖異構(gòu)酶和 6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH，測(cè)定 340nm 下 NADPH 的增加速率，即可計(jì)算 FBP 活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、天平、低溫離心機(jī)、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、冰盒、蒸餾水。

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 20mL 試劑四充分溶解待用，用不完的試劑于 4℃保存。
試劑二：液體 8μL×1 瓶，-20℃保存。臨用前加入 1.1mL 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑三：液體 108μL×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 1.1mL 蒸餾水充分溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑四：液體 25mL×1 瓶，4℃保存。

操作步驟：
一、粗酶液的提?。?/span>
組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱(chēng)取約 0.1g，加入 1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿。于 4℃，8000g，離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min），于 4℃，8000g，離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟：
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 將試劑一 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)預(yù)熱 10min。
3、 操作表：(在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中依次加入下列試劑)

測(cè)定管 空白管
樣本（μL）      20      -
提取液（μL）     -      20
試劑二（μL）    10      10
試劑三（μL）    10      10
試劑一（μL）    160     160
在微量石英比色皿/96 孔 UV 板中分別加入上述試劑，充分混勻后于 340nm 處測(cè)定 10s 時(shí)的吸光值 A1，迅速置于 30℃水浴或培養(yǎng)箱 5min（酶標(biāo)儀有控溫功能可將溫度調(diào)至 30℃），拿出迅速擦干測(cè)定 310s 時(shí)的吸光值 A2，計(jì)算△A 測(cè)定管= A2 測(cè)定-A1 測(cè)定，△A 空白管=A2 空白-A1 空白，△A=△A測(cè)定管-△A 空白管。空白管只需做一次。
FBP 酶活性計(jì)算
1、按微量石英比色皿計(jì)算
（1）按蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
FBP（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反總÷(Cpr×V 樣) ÷T=321.5×ΔA÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計(jì)算
單位的定義：每 g 組織每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
FBP（U/g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.5×ΔA÷W
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每 104個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1 nmol 的 NADPH 定義為一個(gè)酶活力單位。
FBP（U/104cell）=ΔA÷（ε×d）×109×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）) ÷T=321.5×ΔA÷細(xì)胞數(shù)量（萬(wàn)個(gè)）
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L；
ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×103L / mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；
V 樣總：加入提取液體積，1 mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；
W：樣本質(zhì)量，g；
109：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol=109nmol。
2、按 96 孔板計(jì)算
將上述公式中的 d-1cm 改為 d-0.6cm（比色皿光徑）進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)
1、 當(dāng)△A 大于 0.6 時(shí)，建議將樣稀釋后再進(jìn)行測(cè)量。
2、 空白管為檢測(cè)各試劑組分質(zhì)量的檢測(cè)孔，正常情況下，變化不超過(guò) 0.02。