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葡萄糖-6-磷酸酶（G6P）活性檢測(cè)試劑盒說明書
微量法
注意: 正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
英文名稱：Glucose-6-phosphatase activity assay kit
關(guān)鍵詞：葡萄糖-6-磷酸酶|G6P|G6P檢測(cè)
貨號(hào): BC3325
規(guī)格: 100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 120mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：液體 12 mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×2 瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前用 4mL 蒸餾水溶解備用。
試劑四：試劑×1 瓶，4℃保存；臨用前用 4mL 蒸餾水溶解備用。
試劑五：液體 4mL×1 瓶，4℃保存；
標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1mL×1 支。10μmol/mL 磷標(biāo)準(zhǔn)液。

產(chǎn)品說明：
葡萄糖-6-磷酸酶（(glucose 6 phosphatase，G6Pase，EC 3.1.3.9）是一種水解磷酸化合物的磷酸酶，廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和細(xì)胞中，是糖異生過程水解葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖的限制酶，在保證血糖的動(dòng)態(tài)平衡方面起著重要的作用。
G6P 催化葡萄糖-6-磷酸生成葡萄糖和無機(jī)磷，利用鉬藍(lán)法測(cè)定無機(jī)磷含量的增加，即可反映G6P 活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、微量玻璃比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器、EP 管、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、粗酶液提?。?/span>
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：
提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。
3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。
二、測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將 10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋 16 倍至 0.625μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、工作液的配制：試劑二中加入 5mL 試劑一充分溶解備用。
4、定磷試劑的配制：按 H2O:試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。
若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑*用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
5、操作表：
測(cè)定管 對(duì)照管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管
樣品（μL）          20     20
工作液（μL）        80
充分混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或者 25℃（其他物種）水浴反應(yīng) 10min。反應(yīng)后迅速放入沸水中沸水浴 10min。取出冷卻至常溫
工作液（μL）         -     80
10000rpm 常溫離心 10min 后取上清。
上清液（μL）        25     25     -      -
標(biāo)準(zhǔn)溶液（μL）      -       -     25      -
定磷試劑（μL）     125    125    125   125
蒸餾水（μL）       100    100    100   125
充分混勻，40℃反應(yīng) 10min。吸取 200μL 于微量玻璃比色皿或者 96 孔板中，測(cè)量 660nm 處吸光值，測(cè)定管、對(duì)照管、空白管、標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定的吸光度分別記為 A 測(cè)定管、A 對(duì)照管、A 空白管、A 標(biāo)準(zhǔn)管。計(jì)算△A=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管，△A 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管。
三、G6P 活性計(jì)算：
1、血清（漿）G6P 活力計(jì)算
單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成 1nmol 無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活力單位。
G6P（U/mL）=△A÷（△A 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×1000×V 酶促÷V 樣品÷T=312.5×△A÷△A 標(biāo)準(zhǔn)。
2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 G6P 活力計(jì)算
（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位定義：每 mg 組織蛋白每分鐘生成 1nmol 無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活力單位。
G6P（U/mg prot）=△A÷（△A 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×1000×V 酶促÷（Cpr×V 樣品）÷T
=312.5×△A÷△A 標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr。
（2）按樣本鮮重計(jì)算
單位定義：每 g 組織每分鐘生成 1nmol 無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活力單位。
G6P（U/g 鮮重）=△A÷（△A 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×1000×V 酶促÷（W÷V 提取×V 樣品）÷T=312.5×△A÷△A 標(biāo)準(zhǔn)÷W。
（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成 1nmol 無機(jī)磷定義為一個(gè)酶活力單位。
G6P（U/104 cell）=△A÷（△A 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)）×1000×V 酶促÷（500÷V 提取×V 樣品）÷T=0.625×△A÷△A 標(biāo)準(zhǔn)。
C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.625μmol/mL；
V 酶促：酶促反應(yīng)總體積，0.1mL；
V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；
V 提?。杭尤胩崛∫后w積，1 mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，10min；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；
W：樣本質(zhì)量，g；
500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬；
1000：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1μmol=1000nmol。


注意事項(xiàng)：
1、建議將樣品用提取液稀釋后再進(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。
2、若 A 大于 1.5 或者顯色完成后有沉淀產(chǎn)生，將上清液或者粗酶液用蒸餾水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 0.04-5μmol/mL。
4、 定磷試劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，正常顏色為淺黃色，如有變色或變藍(lán)則均為失效。

相關(guān)文獻(xiàn)：

《Hepatic c-Jun regulates glucose metabolism via FGF21 and modulates body temperature through the neural signals》 作者:FeiXiao15YajieGuo15JialiDeng1FeixiangYuan1YuzhongXiao1LijianHui2YuLi1ZhiminHu1YuncaiZhou3KaiLi3XiaoHan3QichenFang4WeipingJia4YanChen1HaoYing1QiweiZhai1ShanghaiChen1FeifanGuo 期刊:Molecular Metabolism 影響因子:6.181 PMID:30579932
《Liver-derived fibroblast growth factor 21 mediates effects of glucagon-like peptide-1 in attenuating hepatic glucose output》 作者:Junling Liu, Kun Yang, Jin Yang, Wenhua Xiao, Yunyi Le, Fei Yu, Liangbiao Gu, Shan Lang, Qing Tian, Tianru Jin, Rui Wei ,Tianpei Hong 期刊:EBioMedicine. 影響因子:6.68 PMID:30827929