乙酰輔酶A羧化酶(ACC)活性檢測試劑盒 可見分光光度法
- 發(fā)布日期: 2019-05-24
- 更新日期: 2025-07-09
產(chǎn)品詳請
產(chǎn)地 |
北京
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品牌 |
Solarbio
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貨號 |
BC0410
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保存條件 |
2-8℃保存
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英文名稱 |
acetyl-CoA carboxylase (ACC) activity assay kit
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CAS編號 |
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保質(zhì)期 |
1年
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乙酰輔酶A羧化酶(ACC)活性檢測試劑盒 可見分光光度法
英文名稱:acetyl-CoA carboxylase (ACC) activity assay kit
關(guān)鍵詞:乙酰輔酶A羧化酶|乙酰輔酶A羧化酶檢測|ACC|ACC檢測
乙酰輔酶 A 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)試劑盒說明書
分光光度法 50 管/24 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義
ACC在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A,是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
測定原理
ACC 能夠催化乙酰輔酶 A、NaHCO3和 ATP 生成丙二酰輔酶 A、ATP 和無機(jī)磷,通過鉬酸
銨定磷法測定無機(jī)磷的增加量來測定 ACC 活性。
需自備的儀器和用品
分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。
試劑的組成
提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;
試劑一:20mL×1 瓶, 4℃保存;
試劑二:粉劑×1 瓶,4℃保存;
試劑三:粉劑×1 瓶,-20℃保存;
試劑四:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25mL 蒸餾水,溶解后 4℃可保存一周。
試劑五:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25mL 蒸餾水,溶解后 4℃可保存一周。
試劑六:液體 25mL×1 瓶,室溫保存。
試劑七:10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。
樣本的前處理
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
(104個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
2、組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,
加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。
測定步驟
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 660nm,蒸餾水調(diào)零。
2、 酶促反應(yīng)試劑的配制和預(yù)熱:在試劑二瓶中加入 6.5mL 試劑一,充分溶解混勻;在試劑三瓶中加入 5mL 蒸餾水,充分溶解混勻;將試劑一、二、三在 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃
(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘。
3、定磷試劑的配制:按 H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷試劑
應(yīng)為淺黃色,若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意:配試劑*用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將試劑七 20 倍稀釋,即取 0.5mL 試劑七加 9.5 蒸餾水,充分混勻。
5、酶促反應(yīng)
試劑名稱(μL) 對照管 測定管
試劑一 450
試劑二 250
試劑三 200
樣本 50 50
37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)準(zhǔn)確反應(yīng) 30min 后,90℃水浴 5min(蓋緊,以防止水分散失),冷卻后,10000g 25℃離心 5min,取上清
6、定磷
標(biāo)準(zhǔn)管 空白管 對照管 測定管
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液 100
蒸餾水 100
上清液 100 100
定磷試劑 900 900 900 900
混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其它物種)水浴 30min,冷卻至室溫,在 660nm 處,蒸餾水調(diào)零,記錄各管吸光值 A。標(biāo)準(zhǔn)管、空白管只要做一次即可,每個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管。
注意:若測定管吸光值大于 2,將樣品用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進(jìn)行測定,使吸光值小于
2,可提高檢測靈敏度,計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。
ACC 活性計(jì)算:
1、按組織蛋白濃度計(jì)算:
定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位。
ACC (μmol/h/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷
(V 樣×Cpr)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算:
定義:每小時(shí)每 g 組織產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位。
ACC (μmol/h/g 鮮重)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W
3、 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:
定義:每小時(shí)每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位。
ACC (μmol/h/104cell)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)×V 總÷(500× V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)
C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;
V 總:酶促反應(yīng)總體積,0.5mL;
V 樣:加入樣本體積,0.05mL ;
V 樣總:加入提取液體積,1mL;
T:反應(yīng)時(shí)間,0.5 小時(shí);
Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;
W:樣本鮮重,g;
500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。