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乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性檢測試劑盒   可見分光光度法

英文名稱：acetyl-CoA carboxylase (ACC) activity assay kit
關(guān)鍵詞：乙酰輔酶A羧化酶|乙酰輔酶A羧化酶檢測|ACC|ACC檢測
乙酰輔酶 A 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase，ACC)試劑盒說明書
 分光光度法 50 管/24 樣
正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義
ACC在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

測定原理
ACC 能夠催化乙酰輔酶 A、NaHCO3和 ATP 生成丙二酰輔酶 A、ATP 和無機(jī)磷，通過鉬酸
銨定磷法測定無機(jī)磷的增加量來測定 ACC 活性。

需自備的儀器和用品
分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸
餾水。

試劑的組成
提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：20mL×1 瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃可保存一周。
試劑五：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25mL 蒸餾水，溶解后 4℃可保存一周。
試劑六：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑七：10μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

樣本的前處理
1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量
（104個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，
加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 酶促反應(yīng)試劑的配制和預(yù)熱：在試劑二瓶中加入 6.5mL 試劑一，充分溶解混勻；在試劑三瓶中加入 5mL 蒸餾水，充分溶解混勻；將試劑一、二、三在 37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃
(其它物種)預(yù)熱 10 分鐘。
3、定磷試劑的配制：按 H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑
 應(yīng)為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑*用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑七 20 倍稀釋，即取 0.5mL 試劑七加 9.5 蒸餾水，充分混勻。
5、酶促反應(yīng)
試劑名稱（μL） 對照管 測定管
試劑一           450
試劑二                  250
試劑三                  200
樣本              50     50
37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng) 30min 后，90℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心 5min，取上清
6、定磷
標(biāo)準(zhǔn)管   空白管   對照管   測定管
0.5μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液        100
蒸餾水                                  100
上清液                                            100     100
定磷試劑                        900      900      900     900
混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃（其它物種）水浴 30min，冷卻至室溫，在 660nm 處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值 A。標(biāo)準(zhǔn)管、空白管只要做一次即可，每個(gè)測定管需要設(shè)一個(gè)對照管。
注意：若測定管吸光值大于 2，將樣品用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進(jìn)行測定，使吸光值小于
2，可提高檢測靈敏度，計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

ACC 活性計(jì)算：
1、按組織蛋白濃度計(jì)算：
定義：每小時(shí)每毫克組織蛋白產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位。
ACC (μmol/h/mg prot)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷
(V 樣×Cpr)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算：
定義：每小時(shí)每 g 組織產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位。
ACC (μmol/h/g 鮮重)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）×V 總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W
3、 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：
定義：每小時(shí)每 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞產(chǎn)生 1μmol 無機(jī)磷的量為一個(gè) ACC 活力單位。
ACC (μmol/h/104cell)=(C 標(biāo)準(zhǔn)管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）×V 總÷(500× V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/mL；
V 總：酶促反應(yīng)總體積，0.5mL；
V 樣：加入樣本體積，0.05mL ；
V 樣總：加入提取液體積，1mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，0.5 小時(shí)；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；
W：樣本鮮重，g；
500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。