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乙酰輔酶A羧化酶（ACC）活性檢測試劑盒   微量法
乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)活性檢測試劑盒說明書
微量法
英文名稱：acetyl-CoA carboxylase (ACC) activity assay kit
關鍵詞：乙酰輔酶A羧化酶|乙酰輔酶A羧化酶檢測
注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。
貨號：BC0415
規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；
試劑一：10mL×1 瓶， 4℃保存；
試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；
試劑三：粉劑×1 瓶，-20℃保存；
試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑五：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入25mL 蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。
試劑六：液體 25mL×1 瓶，室溫保存。
試劑七：10μmol/mL 標準磷貯備液 10mL×1 瓶，4℃保存。

產(chǎn)品說明：
ACC在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
ACC 能夠催化乙酰輔酶A、NaHCO3 和ATP 生成丙二酰輔酶A、ATP 和無機磷，通過鉬酸銨
定磷法測定無機磷的增加量來測定ACC 活性。

需自備的儀器和用品：
分光光度計/酶標儀、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量比色皿/96孔板、研缽、
冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、樣本的前處理
1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：
提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細菌或細胞加入1mL 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30 次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟
1、 分光光度計預熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 酶促反應試劑的配制和預熱：在試劑二瓶中加入2.5mL 試劑一，充分溶解混勻；在試劑三瓶中加入2mL 蒸餾水，充分溶解混勻；將試劑一、二、三在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱10 分鐘。
3、 定磷試劑的配制：按H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。
注意：配試劑*用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
4、0.5μmol/mL 標準磷應用液配制：將試劑七20 倍稀釋，即取 0.5mL 試劑七加9.5 蒸餾水，充分混勻。
5、酶促反應
試劑名稱（μL） 對照管 測定管
試劑一            90
試劑二                   50
試劑三                   40
樣本              10     10
37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準確反應30min 后，90℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 常溫離心5min，取上清。
6、定磷
標準管    空白管     對照管    測定管
0.5μmol/mL 標準磷應用液        20
蒸餾水                                    20
上清液                                               20        20
定磷試劑                       180       180         180       180
混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴30min，冷卻至室溫，在 660nm 處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值A。標準管、空白管只要做一次即可，每個測定管需要設一個對照管。

注意：若測定管吸光值大于2，將樣品用提取液稀釋適當倍數(shù)后再進行測定，使吸光值小于2，可提高檢測靈敏度，計算公式中乘以相應稀釋倍數(shù)。

三、ACC 活性計算：
1、按組織蛋白濃度計算：
定義：每小時每毫克組織蛋白產(chǎn)生1μmol 無機磷的量為一個 ACC 活力單位。
ACC (U/mg prot)=(C 標準管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷(V 樣
×Cpr)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：
定義：每小時每g 組織產(chǎn)生1μmol 無機磷的量為一個 ACC 活力單位。
ACC (U/g 鮮重)=(C 標準管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管）×V 總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=10×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)÷W
3、按細菌或細胞密度計算：
定義：每小時每500 萬細菌或細胞產(chǎn)生1μmol 無機磷的量為一個 ACC 活力單位。
ACC (U/104 cell)=(C 標準管×V 總)×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管）×V 總
÷(500× V 樣÷V 樣總)÷T=0.02×(A 測定管-A 對照管)÷(A 標準管-A 空白管)
C 標準管：標準管濃度，0.5μmol/mL；
V 總：酶促反應總體積，0.5mL；
V 樣：加入樣本體積，0.05mL ；
V 樣總：加入提取液體積，1mL；
T：反應時間，0.5 小時；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；
W：樣本鮮重，g；
500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。