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| 產(chǎn)地 | 北京 |
| 品牌 | Solarbio |
| 貨號 | BC0380 |
| 用途 | |
| 英文名稱 | Pyruvate dehydrogenase (PDH) detection kit |
| 包裝規(guī)格 | |
| 純度 | % |
| CAS編號 | |
| 保質(zhì)期 | 1年 |
| 是否進(jìn)口 |
產(chǎn)品說明：
PDH（EC 4.1.1.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(PDHC) 催化丙酮酸氧化脫羧的限速酶，催化丙酮酸脫梭生成羥乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循環(huán)連接起來。 PDH 催化丙酮酸脫氫，同時還原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），從而導(dǎo)致 605nm 光吸收的少。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽/勻漿器、冰和 蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本的處理 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細(xì)胞，加入 1mL 試劑一和 10μL 試劑二，用冰浴勻漿器或研缽 勻漿充分研磨，4 ℃ 11000 g 離心 10min，取上清，置冰上待測。
二、測定步驟 1、分光光度計預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 605nm，蒸餾水調(diào)零。 2、個樣本需要 900μL 工作液，按樣本數(shù)加一取出一定的工作液于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其 他物種）中孵育 5min。 3、空白管：在 1mL 比色皿中加入 900 μL 工作液和 50μL 水，混勻，立即記錄 605nm 處初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，計算 ?A 空白=A1-A2。 4、測定管：在 1mL 比色皿中加入 900 μL 工作液和 50μL 樣本，混勻，立即記錄 605nm 處初始吸 光值 A3 和 1min 后的吸光值 A4，計算?A 測定=A3-A4。
三、PDH 活性計算
（1） 按樣本蛋白濃度計算 單位的定義： mg 組織蛋白分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH 活性（U /mg prot）=[(?A 測定-?A 空白)×V 反總÷(ε×d)×109]÷(V 樣×Cpr)÷T =904.762×(?A 測定-?A 空白)÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計算 單位的定義： g 組織分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH 活性(U/g 鮮重)=[(?A 測定-?A 空白)×V 反總÷(ε×d)×109]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =913.81×(?A 測定-?A 空白)÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算 單位的定義： 1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞分鐘消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個酶活性單位。 PDH 活性(U/104 cell)=[(?A 測定-?A 空白)×V 反總÷(ε×d)×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T =1.828×(?A 測定-?A 空白) V 反總：反應(yīng)體系總體積，9.5×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm； d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.05 mL；V 樣總：加入試劑一和試劑二體積，1.01 mL； T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬。
注意事項：
1、測定過程中所有樣本在冰上放置，以免變性和失活。
2、測定管的?A 值在 0.01-0.25 之間，若測定管的?A 值大于 0.25，需將樣本進(jìn)行稀釋。
3、由于提取液中含有一定濃度的蛋白（約 1mg/mL），所以在測定樣品蛋白濃度時需要去提取液 本身的蛋白含量。
相關(guān)文獻(xiàn)：
《Engineering Corynebacterium glutamicum for high-titer biosynthesis of hyaluronic acid.》 作者:Fangyu Cheng,Huimin Yu,Gregory Stephanopoulos 期刊:Metab. Eng. 影響因子:7.808 PMID:31301358
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