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NADP 磷酸酶（NADPase）活性檢測(cè)試劑盒說明書
                                                                                       微量法
產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷85A三樓
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
注意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào): BC1115
規(guī)格:100T/48S
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價(jià)格：1180.00
庫(kù)存狀態(tài)：現(xiàn)貨

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
NADPase 主要存在于植物組織中，是生物體內(nèi)*催化NADP+降解為NAD+的酶，與NADK一起調(diào)控NAD 和NADP 之間的平衡。
NADPase 能夠催化NADP+水解為NAD+和無(wú)機(jī)磷的反應(yīng)，通過測(cè)定無(wú)機(jī)磷的量來(lái)測(cè)定NADPase活性。

試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、勻漿器/研缽和蒸餾水

產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體15 mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×2 支，4℃保存；用時(shí)加入1.1 mL 試劑一充分溶解備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。
試劑三：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入8mL 雙蒸水，溶解后4℃可保存一周。
試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入8mL 雙蒸水，溶解后4℃可保存一周。
試劑五：液體8mL×1 瓶，室溫保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液1mL×1 支，4℃保存。
1μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將標(biāo)準(zhǔn)品10 倍稀釋，即取1mL 標(biāo)準(zhǔn)品加9mL 蒸餾水，充分混勻備用。

定磷試劑的配制：按H2O:試劑三:試劑四:試劑五=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑應(yīng)為淺黃色，若無(wú)色則試劑失效，若是藍(lán)色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑*用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

操作步驟：
一、粗酶液提取：
組織樣品：稱取約0.1g 樣品，加提取液1.0 mL 充分研磨，于4℃，8000g 離心10min，取上清液置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟：
1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm，蒸餾水調(diào)零。
2、操作表：
（1）酶促反應(yīng)
試劑名稱（μL）                 測(cè)定管                對(duì)照管
試劑一                                 120                    120
試劑二                                  40                       -
蒸餾水                                                           40
                 37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）預(yù)熱5min
樣本                                      40                     40
37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)20min 后，沸水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 常溫離心10min，取上清。

（2）定磷
                          標(biāo)準(zhǔn)管         空白管          測(cè)定管          對(duì)照管
1μmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液      20
蒸餾水                                     20              
上清液                                                     20              20
定磷試劑                    200            200            200             200

混勻，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）水浴30min，冷卻至室溫，吸取200μL 至微量玻璃比色皿或96 孔板總，在660nm 處記錄各管吸光值，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管、A 空白管、A 測(cè)定管、A 對(duì)照管，并計(jì)算ΔA 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管，ΔA 測(cè)定=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。

NADPase 酶活性計(jì)算：
1、按組織蛋白濃度計(jì)算：
定義：規(guī)定每分鐘每毫克組織蛋白的組織中NADPase 分解NADP 產(chǎn)生1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)NADPase 活力單位。
NADPase (U/mg prot) ＝ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)×V 上清÷（Cpr×V 樣本×V 上清÷V 酶促）÷T=0.25×ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr。

2、按樣本鮮重計(jì)算：
定義：規(guī)定每分鐘每克組織中NADPase 分解NADP 產(chǎn)生1μmol 無(wú)機(jī)磷的量為一個(gè)NADPase 活力單位。
NADPase (U/g 鮮重) ＝ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷C 標(biāo)準(zhǔn)×V 上清÷(W×V 樣本÷V 提取×V 上清÷V 酶促)÷T=0.25×ΔA 測(cè)定÷ΔA 標(biāo)準(zhǔn)÷W。
C 標(biāo)準(zhǔn)：1μmol/mL 的磷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液；
V 上清：定磷試驗(yàn)中上清液體積，0.02mL；
Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；
V 樣本：酶促反應(yīng)中樣本體積，0.04mL；
V 酶促：酶促反應(yīng)總體積，0.2mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，20min；
V 提?。禾崛∫后w積，1mL；
W：樣本鮮重，g。

注意事項(xiàng)：
1、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格，要沒有一點(diǎn)磷，若試管放過磷酸或磷酸鹽緩沖液，一定要洗得非常干凈，要先用洗潔精加水煮，再用自來(lái)水沖，*用蒸餾水沖干凈。*用一次性塑料管或新玻璃管，避免磷污染是檢測(cè)成敗的關(guān)鍵。
2、標(biāo)準(zhǔn)管、空白管只要做一次即可。