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幾丁質(zhì)酶活性檢測試劑盒說明書
微量法

產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷85A三樓
英文名稱：Chitinase activity assay kit
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
注意：正式測定前務(wù)必取2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定。
貨號(hào)：BC0825
規(guī)格：100T/48S
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價(jià)格：1300.00
庫存狀態(tài)：現(xiàn)貨
關(guān)鍵詞：幾丁質(zhì)酶|幾丁質(zhì)酶活性檢測|幾丁質(zhì)酶檢測
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體50mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體15mL×1 瓶，4℃保存，使用前搖勻。
試劑二：液體5mL×1 瓶，4℃保存。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1 瓶。5mg N-乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。臨用前加入2.27mL 蒸餾水配成10μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。


產(chǎn)品說明：
幾丁質(zhì)酶要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動(dòng)物的外殼與軟體動(dòng)物的器官(例如烏賊的軟骨)，以及真菌類的細(xì)胞壁中。而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的作用，成為抗真菌病害的研究熱點(diǎn)。
幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生N-乙酰氨基葡萄糖，進(jìn)一步與3,5-二硝基水楊酸產(chǎn)生棕紅色化合物，在540nm 處有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器
天平、水浴鍋、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽/勻漿器、蒸餾水。

操作步驟：

一、粗酶液提取
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10 的比例（建議稱取約0.1g 組織，加入1mL 提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測。
2. 真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1 的比例（建議500 萬細(xì)胞加入1mL 提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3s，間隔7 s，總時(shí)間3min）；然后10000g，4℃，離心20min，取上清置于冰上待檢。
3. 培養(yǎng)液：直接測定。

二、測定操作表
1、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min。波長調(diào)至540nm，蒸餾水調(diào)零。
2、將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋為5、4、3、2、1μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。
3、在EP 管中分別加入：
試劑名稱             測定管         對(duì)照管           標(biāo)準(zhǔn)管          空白管
樣品（μL）             100            100              -               -
標(biāo)準(zhǔn)溶液（μL）          -              -               100             -
蒸餾水（μL）            -              -                -              100
試劑一（μL）           100             -               100             100
                 混勻，37℃水浴1h，沸水浴5min。
試劑一（μL）            -             100               -               -
8000rpm 常溫離心10min，分別取上清液160μL 于新的EP 管中，再加入下列試劑
試劑二（μL）            40             40               40              40
混勻，沸水浴反應(yīng)10min，立即置于冰上至室溫。于微量玻璃比色皿或96 孔板中測定每管在540nm 下的吸光度，記為A 測定管、A 對(duì)照管、A 標(biāo)準(zhǔn)管、A 空白管。計(jì)算ΔA 測定=A測定管-A 對(duì)照管，ΔA 標(biāo)準(zhǔn)=A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管。

三、計(jì)算公式
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以ΔA 標(biāo)準(zhǔn)為y 軸，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x 軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b。將ΔA 測定帶入標(biāo)準(zhǔn)方程中，得到x（μmol/mL）
2、幾丁質(zhì)酶活的計(jì)算：
（1）按照樣本重量計(jì)算
酶活性定義：37℃下，每g 組織每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（U/g 鮮重）=x×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×W）÷T=x÷W。
（2）按照蛋白質(zhì)濃度計(jì)算
酶活性定義：37℃下，每mg 蛋白每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（U/mg prot）=x×V 樣÷（V 樣×Cpr）÷T =x÷Cpr。
（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算
酶活性定義：37℃下，每104 個(gè)細(xì)胞每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（U/104 cell）=x×V 樣÷（V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量）÷T =x÷細(xì)胞數(shù)量。
（4）按照培養(yǎng)液體積計(jì)算
酶活性定義：37℃下，每mL 培養(yǎng)液每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活性單位。
幾丁質(zhì)酶活性（U/mL）=x×V 樣÷V 樣÷T =x。
V 樣：反應(yīng)體系中樣本體積，0.1mL；
V 樣總：加入提取液體積，1mL；
W：樣本質(zhì)量，g；
Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；
T：反應(yīng)時(shí)間，1h；
細(xì)胞數(shù)量：以萬計(jì)。

注意事項(xiàng)：
1、反應(yīng)結(jié)束后盡快進(jìn)行比色。
2、OD 值大于1.5，樣品適當(dāng)稀釋再測定，注意計(jì)算公式里乘以稀釋倍數(shù)；或者縮短37℃水浴時(shí)間到X 小時(shí)（如0.5 小時(shí)），按照原先計(jì)算公式得到的結(jié)果再除以X。