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| 產(chǎn)地 | 北京 |
| 品牌 | Solarbio |
| 貨號 | BC3235 |
| 用途 | |
| 英文名稱 | Mitochondrial respiratory chain complex II activity detection kit |
| 包裝規(guī)格 | |
| 純度 | % |
| CAS編號 | |
| 保質(zhì)期 | 1年 |
| 是否進(jìn)口 |
產(chǎn)品詳細(xì)描述
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：80mL×2 瓶，4℃保存；
試劑一：液體40mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；溶于1mL丙tong，可分裝后-20℃保存。臨用前再用丙tong100倍稀釋后使用。
試劑三：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加入2mL丙tong溶解備用。
試劑四：液體2.5mL×1 瓶，4℃保存；
產(chǎn)品說明：
線粒體復(fù)合體Ⅱ又稱琥珀酸-輔酶Q 還原酶，廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體中，催化琥珀酸氧化生成延胡索酸，同時(shí)輔基FAD 還原為FADH2，后者進(jìn)一步還原氧化型輔酶Q 生成還原型輔酶Q，是呼吸電子傳遞鏈的支路。
復(fù)合體Ⅱ的催化產(chǎn)物還原型輔酶Q 可進(jìn)一步還原2,6-二氯吲哚酚，2,6-二氯吲哚酚在605nm 有特征吸收峰，通過檢測2,6-二氯吲哚酚的減少速率來計(jì)算該酶活性。
試驗(yàn)中所需的儀器和試劑：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、丙tong、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、復(fù)合體Ⅱ的提?。?/span>
稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1.0 mL提取液，用勻漿器或研缽于冰上勻漿。
4 ℃ 600 g離心10min。
將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心15min。
上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的復(fù)合體Ⅱ（此步可選做，可以判斷線粒體提取效果）。
在沉淀中加入400μL提取液，超聲波破碎（功率20％，超聲5秒，間隔10秒，重復(fù)15次），用于復(fù)合體Ⅱ酶活性測定，并且用于蛋白含量測定。
測定步驟：
可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至605nm，蒸餾水調(diào)零。
樣本測定
工作液的配制：臨用前將試劑二和試劑三按1：1混合，現(xiàn)用現(xiàn)配；
將試劑一37℃（哺乳動物）或25℃（其他物種）預(yù)熱15min；
在微量玻璃比色皿/96孔板中分別加入：
| 試劑名稱 | 測定管 |
| 樣本 | 10 |
| 試劑一 | 150 |
| 工作液 | 20 |
| 試劑四 | 20 |
| 將上述試劑分別加入比色皿/96孔板后迅速吹打混勻，記錄第10s的吸光值A1，盡量在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）環(huán)境中準(zhǔn)確反應(yīng)2分鐘，之后迅速取出記錄2min時(shí)的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。 | |
三、復(fù)合體Ⅱ活力單位的計(jì)算：
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 2，6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體Ⅱ活力(U/mg prot)= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T= 476.2×ΔA÷Cpr
V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。
（2）以96孔板計(jì)算：將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm進(jìn)行計(jì)算即可
注意事項(xiàng)：
為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，需先取1-2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果測定的吸光值過高（高于1.5），可用蒸餾水稀釋上清液后再測定。計(jì)算結(jié)果時(shí)注意乘以稀釋倍數(shù)。若ΔA大于0.4，需將樣本稀釋適當(dāng)倍數(shù)（計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)）；若ΔA偏小，則可以通過增加加入的樣品體積來提高靈敏度。
樣品蛋白濃度需自行測定，推薦我公司BCA蛋白濃度測定試劑盒。由于提取液中含有蛋白，所以在測定樣品蛋白濃度時(shí)需要減去提取液本身的蛋白含量。
推薦使用樣本蛋白濃度計(jì)算酶活，若用樣本鮮重計(jì)算，則需加測胞漿提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方為總酶活。
本試劑盒試劑足夠完成25管反應(yīng)。
附:使用樣本重量計(jì)算公式：（樣本檢測數(shù)為25T/12S）
A、上清中復(fù)合體II活力的計(jì)算:
按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體II活性（U/g）= [ΔA1×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V樣本)）÷T
=476.2×ΔA1÷W。
ΔA1：上清測定值；V 反總：反應(yīng)體系總體積，10-3 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL ；V 樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本重量，g。
B、沉淀中復(fù)合體II活力的計(jì)算:
按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯吲哚酚定義為一個(gè)酶活力單位。
復(fù)合體II活性（U/g）= [ΔA2×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W÷V提取×V樣本)）÷T
=190.5×ΔA2÷W。
ΔA2：沉淀測定值；V 反總：反應(yīng)體系總體積，10-3 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩爾消光系數(shù)，2.1×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V提?。撼恋碇貞殷w積，0.4mL ；V 樣：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本重量，g。
C、樣本復(fù)合體II總活力的計(jì)算:
樣本復(fù)合體II總活力即為上清中復(fù)合體II活力與沉淀中復(fù)合體II活力之和。
按樣本鮮重計(jì)算：
復(fù)合體II（U/g 鮮重）=476.2×ΔA1÷W +190.5×ΔA2÷W。
相關(guān)文獻(xiàn)：
《A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum》 作者:Qiuli OuYang, Nengguo Tao* and Miaoling Zhang 期刊:Frontier in Immunology 影響因子:4.259 PMID:29503638
