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線粒體轉(zhuǎn)氫酶-2（TH-2）試劑盒說明書
微量法 100 管/96 樣
正式測定前務(wù)必取2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷85A三樓
英文名稱：Transhydrogenase-2 activity assay kit
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
貨號: BC3265
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價格：780
庫存狀態(tài)：現(xiàn)貨
關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)氫酶-2|轉(zhuǎn)氫酶-2活性檢測|轉(zhuǎn)氫酶|轉(zhuǎn)氫酶活性檢測
測定意義
TH 位于線粒體的內(nèi)膜上， 又稱為線粒體復(fù)合體六， 催化NADH+NADP+ 和NAD++NADPH 相互轉(zhuǎn)化，調(diào)節(jié)線粒體NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反應(yīng)稱為TH-2，催化NADPH 和NAD+生成NADP+和NADH。

測定原理
NADH 和NADPH 均在340nm 有特征吸收，因此TH 催化的轉(zhuǎn)氫反應(yīng)不能導(dǎo)致340nm吸光度發(fā)生變化。用人工合成底物3-乙酰pi啶腺嘌呤二核苷酸（APAD+）替代NAD+，TH-2催化APAD+還原生成APADH，APADH 在375nm 有特征光吸收，測定375nm 光吸收的增加速率，來計(jì)算TH-2 活性。

需自備的儀器和用品
可見分光光度計(jì)、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制
試劑一：液體100mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：液體50mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：液體18mL×1 瓶，4℃保存；
試劑四：粉劑×1 支，-20℃保存；
試劑五：粉劑×1 支，-20℃保存；

樣本的前處理：
組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
① 準(zhǔn)確稱取0.1g 組織或收集500 萬細(xì)胞，加入1mL 試劑一，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
② 將勻漿600g，4℃離心5min。
③ 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
④ 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的TH-2（此步可選做）。
⑤ 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入500uL 試劑二，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10 秒，重復(fù)30 次），用于TH-2 活性測定。

測定步驟：
1、 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min 以上，調(diào)節(jié)波長至375nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 樣本測定
（1）工作液的配制：臨用前將試劑四、五轉(zhuǎn)移到試劑三中混合溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；現(xiàn)配現(xiàn)用；
（2）在微量石英比色皿或96 孔板中加入20μL 樣本和180μL 工作液，混勻，立即記錄375nm處初始吸光值A(chǔ)1 和 10min 后的吸光值A(chǔ)2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

TH-2 活性計(jì)算
a.用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位。
TH-2 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位。
TH-2 活性（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=74.5×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位。
TH-2 活性（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.149×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；
ε：APADH 摩爾消光系數(shù)，6.7×103 L / mol /cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；
V 樣總：加入提取液體積，0.5mL；
T：反應(yīng)時間，10 min；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；
W：樣本質(zhì)量，g；
500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。
b.用96 孔板測定的計(jì)算公式如下
（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位。
TH-2 活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr
（2） 按樣本鮮重計(jì)算
單位的定義：每g 組織每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位。
TH-2 活性（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T=149×ΔA÷W
（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算
單位的定義：每1 萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘產(chǎn)生1 nmol APADH 定義為一個酶活性單位。
TH-2 活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T=0.298×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4 L；
ε：APADH 摩爾消光系數(shù)，6.7×103 L / mol /cm；
d：96孔板光徑，0.5cm；
V 樣：加入樣本體積，0.02 mL；
V 樣總：加入提取液體積，0.5mL；
T：反應(yīng)時間，10 min；
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；
W：樣本質(zhì)量，g；
500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。