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單寧酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書
微量法

產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷85A三樓
英文名稱:
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào)：BC4075
規(guī)格：100T/48S
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價(jià)格：1120
庫(kù)存狀態(tài)：現(xiàn)貨
關(guān)鍵詞：?jiǎn)螌幟富钚詸z測(cè)|單寧酶活性測(cè)定|單寧酶|單寧酶測(cè)定
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體100mL×2瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入2mL無(wú)水乙醇混勻溶解。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1瓶，4℃保存。5mg 沒(méi)食子酸丙酯，臨用前加入1.178mL無(wú)水乙醇充分混勻溶解，配成20μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

產(chǎn)品說(shuō)明：
單寧酶全稱是單寧酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，存在于富含單寧的植物，也廣泛存在于微生物中，可以水解酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒(méi)食子酸和葡萄糖。
使用沒(méi)食子酸丙酯（PG）作為單寧酶酶促反應(yīng)的底物，其在270nn下有特征吸收峰，根據(jù)其反應(yīng)前后吸光度的變化來(lái)計(jì)算單寧酶活力。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、乙醇、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、樣本處理：
（1）組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。10000rpm 4℃離心10分鐘，取上清，置冰上待測(cè)。
（2）細(xì)胞或微生物樣品的制備：先收集細(xì)胞或微生物樣品到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬(wàn)細(xì)胞或微生物加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。10000rpm，4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。
二、測(cè)定步驟：
（1）紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至270nm。蒸餾水調(diào)零。
（2）將20μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用提取液稀釋為0.05μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其在270nm下的吸光度，記為A標(biāo)準(zhǔn)。
（3）吸取0.02mL樣品于1.5mLEP管中作為對(duì)照管，沸水浴5min,冷卻至常溫。
（4）加樣表：在1.5mLEP管中分別加入
試劑名稱（μL）        測(cè)定管        對(duì)照管
提取液                 170           170
試劑一                  10            10
樣品                    20            20（已滅活）
40℃水浴反應(yīng)10min后馬上沸水浴5min，冷卻后常溫10000rpm離心10min，取上清。
在微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入下列試劑：
上清液                  10            10
提取液                  190           190
充分混勻后測(cè)定270nm下的吸光度，分別記為A測(cè)定管、A對(duì)照管，計(jì)算ΔA=A對(duì)照管-A測(cè)定管。

三、單寧酶活力計(jì)算：
1、按蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol PG的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
單寧酶（U/mg prot）=ΔA÷（A標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×1000×F×V酶促÷（V樣品×Cpr）÷T=1000×ΔA÷A標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr
2、按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol PG的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
單寧酶（U/g 鮮重）=ΔA÷（A標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×1000×F×V酶促÷（V樣品×W÷V提?。耇=1000×ΔA÷A標(biāo)準(zhǔn)÷W
3、按細(xì)胞或微生物個(gè)數(shù)計(jì)算：
單位的定義：每104個(gè)細(xì)胞或微生物在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol PG的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
單寧酶（U/104 cell）=ΔA÷（A標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×1000×F×V酶促÷（V樣品×500÷V提?。耇=1000×ΔA÷A標(biāo)準(zhǔn)

C 標(biāo)準(zhǔn)： 標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度， 0.05μmol/mL ；
F ： 上清液的稀釋倍數(shù)， 上述反應(yīng)體系中
F=200μL÷10μL=20；
1000：1μmol=1000nmol；
V樣品：加入的樣品體積，0.02mL；
V酶促：酶促反應(yīng)總體積，0.2mL；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；
W：樣品質(zhì)量，g；
V提?。禾崛∫后w積，1mL；
500：500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；
T：反應(yīng)時(shí)間，10min。

注意事項(xiàng)：
1、如果A測(cè)定管大于1.5，可以適當(dāng)加大稀釋倍數(shù)，保證總體積1mL不變，如5μL上清液和195μL試劑一（相當(dāng)于F=200/5=40），計(jì)算公式中需改變F和V上清液的數(shù)值。