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肉桂酸-4-羥化酶（C4H）活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法

產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷85A三樓
英文名稱：Cinnamate 4-hydroxylase (C4H) activity assay kit
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào)：BC4085
規(guī)格：100T/96S
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價(jià)格：1760
庫(kù)存狀態(tài)：現(xiàn)貨
關(guān)鍵詞：肉桂酸-4-羥化酶|肉桂酸-4-羥化酶活性檢測(cè)|C5H|C5H活性檢測(cè)
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體100mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×2瓶，4℃保存。臨用前加入2mL乙醇溶解備用。
試劑三：粉劑×2瓶，4℃保存。臨用前每瓶加入2mL雙蒸水充分溶解待用。現(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：
C4H又稱反式肉桂酸-4-單氧化酶，是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、菌類(lèi)中，屬于細(xì)胞木質(zhì)素合成途徑中間的關(guān)鍵酶。
C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸鹽和NADP，在340nm下測(cè)定NADPH的減少速率，即可反映C4H活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研缽/勻漿器、乙醇、冰和蒸餾水。

操作步驟：
一、樣本處理：
（1）組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心15分鐘，取上清，置冰上待測(cè)。
（2）細(xì)胞或微生物樣品的制備：先收集細(xì)胞或微生物樣品到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬(wàn)細(xì)胞或微生物加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。12000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。

二、測(cè)定步驟：
（1）紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至340nm。蒸餾水調(diào)零。
（2）加樣表：微量石英比色皿/96孔UV板中分別加入
試劑名稱（μL）       測(cè)定管
試劑一                140
試劑二                 20
試劑三                 20
樣品                   20
充分混勻后立即測(cè)定10s時(shí)在340nm下的吸光度，記為A1，之后迅速將其放入37℃水浴或37℃培養(yǎng)箱中3min（若酶標(biāo)儀帶有控溫功能，將溫度調(diào)為37℃）。然后迅速拿出擦凈后測(cè)定190s時(shí)的吸光度，記為A2。計(jì)算ΔA=A1-A2。

三、C4H活力計(jì)算：
1、按微量石英比色皿計(jì)算：
（1） 按蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADPH的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
C4H（U/mg prot）=[ΔA÷(ε×d)×109×V反總]÷(V樣×Cpr)÷T =535.91×ΔA÷Cpr。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmol NADPH的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
C4H（U/g 鮮重）=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反總]÷(W÷V提取×V樣)÷T =535.91×ΔA÷W。
（3） 按細(xì)胞或微生物個(gè)數(shù)計(jì)算：
單位的定義：每104個(gè)細(xì)胞或微生物在反應(yīng)體系中每分鐘減少1nmolNADPH的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
C4H（U/104 cell）=[ΔA÷(ε×d) ×109×V反總]÷(500÷V提取×V樣)÷T =1.072×ΔA。

V反總：反應(yīng)總體積，2×10-4L；
ε：NADPH的摩爾消光系數(shù)，6.22×103 L/mol/cm；
d：比色皿光徑，1cm；
V樣：加入的樣品體積，0.02mL；
Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；
W：樣品質(zhì)量，g；
V提?。禾崛∫后w積，1mL；
500：500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；
T：反應(yīng)時(shí)間，3min。
2、按96孔UV板計(jì)算：
將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm（96孔板光徑）進(jìn)行計(jì)算即可

注意事項(xiàng)：
1、當(dāng)ΔA大于0.4時(shí)，建議將樣品用提取液稀釋后測(cè)量；ΔA過(guò)小時(shí)，建議增加酶促反應(yīng)時(shí)間（5min或10min）或增加加入的樣品體積來(lái)測(cè)定。