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酪氨酸酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法

產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷85A三樓
英文名稱：Tyrosinase activity assay kit
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào)：BC4055
規(guī)格：100T/96S
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價(jià)格：760
庫(kù)存狀態(tài)：現(xiàn)貨
關(guān)鍵詞：酪氨酸酶活性檢測(cè)|酪氨酸酶活性|酪氨酸酶
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體125mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×3瓶，4℃保存。臨用前每瓶加入7mL提取液充分溶解待用?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

產(chǎn)品說(shuō)明：
酪氨酸酶（tyrosinase：EC1.14.18.1）是一種單酚單加氧酶，是具有雙功能的含銅糖蛋白，廣泛存在于植物、酵母和動(dòng)物組織中。酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶，也是引起果蔬酶促褐變的主要因素，同時(shí)也對(duì)昆蟲(chóng)的免疫及生長(zhǎng)有重要影響酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素，其在475nm下有特征吸收峰，進(jìn)而測(cè)定出酪氨酸酶的活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、冰、蒸餾水。

操作步驟：
一、樣本處理：
（1）組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。12000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。
（2）細(xì)胞或微生物樣品的制備：先收集細(xì)胞或微生物樣品到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬(wàn)細(xì)胞或微生物加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。12000g，4℃離心20min，取上清，置冰上待測(cè)。
（3）血清（漿）：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟：
（1）分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至475nm。蒸餾水調(diào)零。
（2）加樣表：
在微量玻璃比色皿/96孔板中分別加入
試劑名稱（μL）    測(cè)定管
試劑一              180
樣品                 20
充分混勻后立即測(cè)定10s時(shí)在475nm下的吸光度，記為A1，之后迅速將其放入37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）水浴或培養(yǎng)箱中3min（若酶標(biāo)儀自帶控溫功能，將溫度調(diào)至37℃或25℃）。然后迅速拿出擦凈后測(cè)定190s時(shí)的吸光度，記為A2。計(jì)算ΔA=A2-A1。

三、酪氨酸酶活力計(jì)算：
1、按微量玻璃比色皿計(jì)算：
(1) 按蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
酪氨酸酶（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(V樣×Cpr)÷T =90.09×ΔA÷Cpr。
(2) 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
酪氨酸酶（U/g 鮮重）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(W÷V提取×V樣)÷T =90.09×ΔA÷W。
(3) 按細(xì)胞或微生物個(gè)數(shù)計(jì)算：
單位的定義：每104個(gè)細(xì)胞或微生物每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
酪氨酸酶（U/104 cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷(500÷V提取×V樣)÷T =0.18×ΔA。
(4) 按樣品體積計(jì)算：
單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
酪氨酸酶（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×109÷V樣÷T =90.09×ΔA。

V反總：反應(yīng)總體積，2×10-4L；
ε：多巴色素的摩爾消光系數(shù)：3.7×104 L/mol/cm；
d：比色皿光徑，1cm；
109：1 mol=109 nmol；
V樣：加入的樣品體積，0.02mL；
Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；
W：樣品質(zhì)量，g；
V提取：提取液體積，1mL；
500：500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；
T：反應(yīng)時(shí)間，3min。
2、按96孔板計(jì)算將上述公式中的d-1cm改為d-0.6cm 進(jìn)行計(jì)算即可。

注意事項(xiàng)：
1、當(dāng)分光光度計(jì)ΔA大于0.3或酶標(biāo)儀ΔA大于0.2時(shí)，建議將樣品用提取液稀釋后測(cè)量；ΔA過(guò)小時(shí)，建議增加酶促反應(yīng)時(shí)間（5min或10min）或增加加入的樣品體積來(lái)測(cè)定。
2、試劑一溶解后易氧化。溶解后盡快用完。