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吲哚乙酸氧化酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)
微量法

產(chǎn)地：北京市通州區(qū)馬駒橋聯(lián)東U谷85A三樓
英文名稱：Indoleacetic acid oxidase activity detection kit
產(chǎn)品商標(biāo)：solarbio
注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。
貨號(hào)：BC4105
規(guī)格：100T/48S
保存與運(yùn)輸：4℃保存或-20℃保存；            
參考價(jià)格：1160
庫(kù)存狀態(tài)：現(xiàn)貨
關(guān)鍵詞:吲哚乙酸氧化酶|吲哚乙酸氧化酶活性檢測(cè)|吲哚乙酸氧化酶活性
產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體60mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入5mL蒸餾水備用。
試劑二：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入3mL蒸餾水備用。
試劑三：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加入5.71mL 50%乙醇（乙醇（V）：H2O（V）=1：1）溶解備用。可以分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融。
試劑四：液體30mL×1瓶，4℃保存。
試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入15mL試劑四溶解。
標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1支，-20℃保存，10mg 吲哚乙酸。臨用前加入1.14mL 50%乙醇（乙醇（V）：H2O（V）=1：1）溶解制成50μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液?？煞盅b后-20℃保存。

產(chǎn)品說(shuō)明：
吲哚乙酸（IAA）在吲哚乙酸氧化酶的作用下，被氧化破壞失去活性。IAA氧化酶能調(diào)節(jié)植物體內(nèi)吲哚乙酸的的水平，從而影響植物的生長(zhǎng)。
IAA在無(wú)機(jī)酸條件下與FeCl3作用生成紅色產(chǎn)物，在530nm下有*吸收峰。酶活力的大小可用破壞IAA的速率表示。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：
可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器、乙醇、冰和蒸餾水。

測(cè)定操作：
1、樣本處理：
（1）組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。12000g 4℃離心15分鐘，取上清，置冰上待測(cè)。
（2）細(xì)胞或微生物樣品的制備：先收集細(xì)胞或微生物樣品到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬(wàn)細(xì)胞或微生物加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。12000g，4℃離心15min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、操作步驟：
（1）可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至530nm。蒸餾水調(diào)零。
（2）將標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。
（3）加樣表：
試劑名稱（μL）        測(cè)定管       對(duì)照管        標(biāo)準(zhǔn)管         空白管
提取液                  40           40             -             -
試劑一                   8            8             -             -
試劑二                    8             8             -              -
試劑三                   16            16             -              -
樣品                      8             -              -             -
上述試劑混勻后30℃水浴反應(yīng)30min。- -
試劑四80 80 80 80
樣品                      -             8               -             -
標(biāo)準(zhǔn)品                    -             -               80             -
蒸餾水                    -             -                -              80
10000g 常溫離心10min，取上清液。- -
上清液                   130            130              -             -
標(biāo)準(zhǔn)品混合液                                            130            130
試劑五                    70             70              70            70
30℃避光放置30min，之后分別測(cè)量530nm處的吸光值，分別記為A測(cè)定管、A對(duì)照管、A標(biāo)準(zhǔn)管、A空白管，計(jì)算ΔA=A對(duì)照管-A測(cè)定管，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。

IAA氧化酶活力計(jì)算：
1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：
以標(biāo)準(zhǔn)液的濃度為x軸，對(duì)應(yīng)的ΔA標(biāo)準(zhǔn)為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將ΔA帶入方程中計(jì)算得x（μmol/mL）
2、IAA氧化酶活力計(jì)算：
（1） 按蛋白濃度計(jì)算：
單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol IAA的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
IAA氧化酶（U/mg prot）=x×V酶促×1000÷(V樣×Cpr)÷T=333×x÷Cpr。
（2） 按樣本鮮重計(jì)算：
單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol IAA的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
IAA氧化酶U/g 鮮重）= x×V酶促×1000÷(W÷V提取×V樣)÷T =333×ΔA÷W。
（3） 按細(xì)胞或微生物個(gè)數(shù)計(jì)算：
單位的定義：每104個(gè)細(xì)胞或微生物在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1nmol IAA的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。
IAA氧化酶（U/104 cell）= x×V酶促×1000÷(500÷V提取×V樣)÷T =0.667×ΔA。

V酶促：酶促反應(yīng)總體積，0.08mL；
1000:1μmol=1nmol；
V樣：加入的樣品體積，0.008mL；
Cpr：樣品蛋白濃度，mg/mL；
W：樣品質(zhì)量，g；
V提?。禾崛∫后w積，1mL；
500：500萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；
T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

注意事項(xiàng)：
1、當(dāng)ΔA大于0.4或者A對(duì)照管大于1時(shí)，建議將樣品用提取液稀釋后進(jìn)行測(cè)定；ΔA過(guò)小時(shí)，可增加酶促反應(yīng)時(shí)間（1h或2h）或增加加入的樣品體積來(lái)測(cè)定。
2、試劑一溶解變黑后則不能使用；試劑二有毒性，做好防護(hù)措施。